Grundlegende Tipps für die Kryokonservierung von Zellkulturen

Grundlegende Tipps für die Kryokonservierung von Zellkulturen

Die Zellen setzen ihren Stoffwechsel während der normalen Wachstumsaktivitäten fort, die die Teilnahme verschiedener Proteasen erfordert. Wenn die Temperatur unter -70 ° C sinkt, funktioniert Proteasen nicht mehr. Daher können Zellen in einer Umgebung mit extrem niedrigen Temperaturen ihre Stoffwechselaktivitäten stoppen und in einen ruhenden Zustand eintreten, der eine langfristige Lagerung ermöglicht.

1. Experimentelle Materialien

Basismaterial:

Grundkulturmedium

Serum (herkömmliche FBS/NBS)

Ultrapure Workbench

Sterile Dimethylsulfoxid (DMSO)

Sterile PBS -Phosphatpuffersalzlösung

Pipettierpistole

Elektrische Pipettierpistole

Herstellung der Experimente

a) Vorbereitung der Gefrierlösung:

Allgemeine Zellen: 55% Basalmedium + 40% Rinderserum (FBS/NBS) + 5% DMSO

Vitalzellen: 90% Rinderserum (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquot der vorbereiteten Kryokonservierungslösung in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen [Nest] und speichern Sie für spätere Verwendung bei 4 ° C.

(b) Herstellung von Zellen, die eingefroren werden sollen:

Wählen Sie vor dem Einfrieren der Zellen Zellen mit gutem Wachstumsstatus und in der logarithmischen Wachstumsphase aus und ersetzen Sie sie 12-24 Stunden vor dem Einfrieren durch frisches Medium, um den Zellzustand aufrechtzuerhalten.

2. Experimentelles Verfahren

1. Beobachten Sie die Dichte der Zellen, die eingefroren werden sollen, was etwa 80%~ 90%beträgt. Verwenden Sie eine Pipette-Pistole, um das alte Medium abzusaugen, fügen Sie sterile PBS hinzu, um die Zellen 1-2-mal zu waschen, und entfernen Sie das verbleibende Medium in der Kulturumgebung.

2. Fügen Sie eine angemessene Menge an Trypsin oder Verdauungssaft hinzu, damit das Trypsin die Zellen betreten kann, und legen Sie sie zur Verdauung in den Inkubator. Beobachten Sie den Zustand der Zellen unter dem Mikroskop: Das Zytoplasma zieht sich zurück und die Zellen sind nicht mehr in Blätter verbunden. Fügen Sie an diesem Punkt die Stopplösung hinzu, um den Verdauungsprozess zu stoppen.

3. Blasen Sie die Zellen vorsichtig mit einer Spitze, um eine Zellsuspension zu bilden und die Zellsuspension bei 1000 U / min für 3-5 Minuten zu bilden.

Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie eine angemessene Menge an Gefrierlösung hinzu und pipettieren Sie es vorsichtig, damit die Zellen gleichmäßig zählen. Passen Sie die Zelldichte mit dem Kryokonservierungsmedium an, um die endgültige Dichte 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml zu machen.

4. Verwenden Sie eine Pipettenpistole, um die kryogenen Röhrchen entsprechend der erwarteten Kapazität zu trennen, und verwenden Sie eine automatische Kackmaschine, um zu kappen und zu versiegeln.

5. Das Standard -Kryokonservierungsprogramm ist eine Kühlrate von -1 ° C bis -2 ° C/min, und die zu eingefrorenen Zellen können nach den folgenden Schritten allmählich eingefroren werden: Raumtemperatur → 4 ° C (20 min) → - 20 ° C (30 min) → -80 ° C ° C (über Nacht) → Langzeitspeicher in flüssigem Stickstoff.

Es kann auch über Nacht direkt in einem Gefrierschrank bei -80 ° C gelagert und dann zur Lagerung auf flüssigen Stickstoff übertragen werden.

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